BACTERIOLOGÍA

BACTERIOLOGÍA

Es la rama de la Biología que estudia la morfología, ecología, genética y bioquímica de las bacterias así como otros muchos aspectos relacionados con ellas. Es de gran importancia para el hombre por sus implicaciones médicas, alimentarias y tecnológicas.

BACTERIA.

Las bacterias son organismos unicelulares procariontes, esto quiere decir que están formados por una sola célula carente de núcleo.

° Las bacterias pertenecen al reino Procarionte.
° Son elementos unicelulares sin un núcleo verdadero.
° Su tamaño aproximado es de 1-3 micras.

ESTRUCTURA BACTERIANA

La estructura bacteriana se divide en:

Elementos siempre presentes:

° Pared bacteriana.
° Membrana citoplasmatica.
° Citoplasma.
° Ribosomas.
° Nucleido o cromosoma bacteriano.

Elementos Facultativos:

° Capsula.
° Flagelos.
° Fimbrias o pili.
° Esporo.
° Glicocalix.
° Plasmidos.
° Transposones.

PARED BACTERIANA.

° Se pone de manifiesto con la tinción de Gram.
° Permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos:
Grampositivos y Gramnegativos
° Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria formada por peptidoglucanos.

° Su espesor varía según se trate de bacterias grampositivas o gramnegativas.

° La protege de los cambios de la presión osmótica del medio que la rodea.
° Es el lugar donde se localizan numerosos determinantes anti génicos que permiten diferenciar a las bacterias entre si.
° La endotoxina de algunos grupos también se encuentra aquí.
° La pared celular se constituye (se “fabrica”) mediante una serie de etapas enzimáticas en las que participan al menos 30 enzimas.
° Es el sustrato donde actúan anti microbianos como los beta-lactámicos.
Participa en la división celular.

MEMBRANA CITOPLASMATICA.

° Esta formada por fosfolipidos y proteínas, y a diferencia de las eucariotas, no contiene esteroles.
° Las enzimas del transporte electrónico se encuentran aquí (produce energía).
° Componentes de la capsula y la pared celular son sintetizados aquí.

° Las bacterias gramnegativas tienen dos membranas: una interna y otra externa, mientras que las grampositivas, solo poseen una membrana (interna).
° Es sitio de acción de detergentes y antibióticos polipeptídicos como la polimixina (Por ejemplo: colistin).

CITOPLASMA

° Formado 85 % por agua.
° Contiene los ribosomas y el cromosoma bacteriano.

RIBOSOMAS 

° Compuestos por ARN ribosomico.
° Su importancia radica en ser el sitio de accion de numerosos antibioticos

NUCLEOIDE O CROMOSOMA BACTERIANO

° Llamado también equivalente nuclear.
° No posee membrana nuclear (de alli el termino nucleoide).
° Esta formado por un unico filamento de ADN apelotonado (superenrollado).
° Confiere sus peculiaridades geneticas a la bacteria.
° Regula la sintesis proteica.
CAPSULA
Estructura polisacarida de envoltura.
Factor de virulencia de la bacteria.
Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasion.
Permite la diferenciacion en tipos serologicos.
FLAGELOS
Estructuras proteicas, de mayor longitud que los pili.
De estructura helicoidal y locomotores (responsables de la motilidad bacteriana).
Según la posicion de los flagelos tenemos bacterias.

FIMBRIAS O PILI 

° Son estructuras cortas parecidas a pelos. Visibles solo al Microscopio Electronico. 

° Carentes de motilidad.
° Los poseen fundamentalmente las Gramnegativas.
° Intervienen en la adherencia de las bacterias al huesped.
° Facilitan el intercambio de ADN durante la conjucion bacteriana. Tiene capacidad antigenica.

ESPORAS

° Estructura presente en algunas especies bacterianas exclusivamente bacilares.
° Le permite a la celula sobrevivir en condiciones extremadamente duras.
° El material genetico de la celula se concentra y es rodeado por una capa protectora, que hace que la celula sea impermeable a la desecacion, al calor y numerosos agentes quimicos.
° Se coloca en una situacion metabolica de inercia.
° Puede permancer meses o años asi.
° Cuando las condiciones son mas favorables se produce la germinacion, con la formacion de una celula unica que despues se reproduce con normalidad.
° El esporo no se tiñe con los colorantes habituales y se identifica como una zona clara, redondeada u ovalada, que contrasta con el resto de la bacteria que aparece coloreada.

GLICOCALIX

° Entramado de fibrillas polisacaridas situadas en posicion extracelular. Facilita la adherencia.

PLASMIDOS Y TRANSPOSONES

° Los plásmidos (plasmidios) son elementos extracromosómicos compuestos por ADN de doble cadena, con frecuencia circular, autoreplicativos y autotransferibles.
° Los transposones (genes saltarines o móviles) son elementos compuestos de ADN que pueden moverse de forma autosuficiente a diferentes partes del genoma bacteriano.
° No poseen la capacidad de autoreplicarse pero pueden transferirse a traves de plasmidios.
° El transposon al cambiar de posicion puede arrastrar una secuencia de ADN contigua y originar cambios fenotipicos en la bacteria.

TAXONOMÍA Y POSTULADOS DE ROBERTO KOCH

TAXONOMÍA

Taxonomía se encarga de nombrar, clasificar y ordenar los organismos.

Es la categorización o clasificación de cosas basado en un sistema predeterminado y tiene su origen en un vocablo griego que significa “ordenación”. Se trata de la ciencia de la clasificación que se aplica en la biología para la ordenación sistemática y jerarquizada de los grupos de animales y de vegetales.

La taxonomía biológica forma parte de la biología sistemática, dedicada al análisis de las relaciones de parentesco entre los organismos. Una vez que se resuelve el árbol filogenético del organismo en cuestión y se conocen sus ramas evolutivas, la taxonomía se encarga de estudiar las relaciones de parentesco.
Existen diferentes posturas respecto a la taxonomía, aunque en general se sostiene que su función comienza cuando ya está definida la filogenia de los taxones. Por eso la taxonomía organiza el árbol filogenético dentro de un sistema de clasificación, la visión más extendida entiende a los taxones como clados (ramas del árbol filogenético, con especies emparentadas por un antepasado común) que ya fueron asignados a una categoría taxonómica.

POSTULADOS DE ROBERTO KOCH 

Los postulados de Koch fueron formulados por Robert Koch, a partir de experimentos con el Mycobacterium tuberculosis. Fueron aplicados para establecer la etimología de la tuberculosis, pero ha sido generalizado para el resto de las enfermedades infecciosas con objeto de saber cual es el agente participante.

Postulados Originales de Koch:

1.- El microorganismo debe encontrarse en todos los pacientes con la enfermedad en cuestión y su distribución en el cuerpo debería corresponder a las lesiones observadas.

2.-El microorganismo no debe aparecer en otra enfermedad de forma fortuita o saprofita.

3.- El microorganismo debe aislarse de las lesiones de una persona infectada y se debe obtener un cultivo puro.

4.- El cultivo puro inoculado en animales experimentales debe producir la enfermedad.

5.- El microorganismo deberá aislarse en un cultivo puro a partir del animal infectado intencionalmente.

Versión molecular de los postulados de Koch:

1.- El gen (o su producto) debe encontrarse en cepas bacterianas que causan la enfermedad y no en bacterias que no son virulentas,

2.- La in activación específica del gen o los genes asociadas a virulencia deben conducir a una pérdida de la patogenicidad o virulencia.

3.-Alternativamente, la introducción del gen clonado en una cepa virulenta debe convertirla en una cepa virulenta.

4.- Debe demostrarse que el gen asociado a virulencia sea expresado por la bacteria cuando está en algún animal experimental en cualquier etapa del proceso infeccioso. Los anticuerpos dirigidos contra el producto del gen deben ser protectores para el hospedero, el producto del gen debe inducir una inmunidad protectora.

MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

2- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

a) Su consistencia

b) Su utilización

c) Su composición

d) Su origen

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.

3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias

SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).

3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.

7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.

8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:

a) haciendo pases periódicos de placa a placa,

b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y

c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.

3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma
de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.

Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.

Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero.

Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.

Agar Hektoen :Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este medio.

C.P.S. ID3. :Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo.

Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente

Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.

Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).

Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.

Medio de Loeffler: Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.

Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez.

Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico.

Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.

Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.

Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios.

Agar Gardnerella:Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis

Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia.

Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella

Löwenstein-Jensen:Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

MORFOLOGÍA BACTERIANA

Morfología bacteriana

Formas generales de las bacterias:
 Oval o esférica (cocos)
 Cilíndrica o de bastón(bacilos)
 Espiral o helicoidal(espirilos)

Cocos.

Los cocos son células casi esféricas y pueden existir como células individuales o se asocian en agrupaciones.

Agrupaciones de los cocos:

 Diplococos
 Estreptococos
 Tetracocos
 Sarcina
 Estafilococos

                                                                       Bacilos.

Los bacilos varían considerablemente entre la proporción de longitud y diámetro siendo los cocobacilos tan cortos y anchos.
 Cocobacilo
 Diplobacilo
 Bacilo
 Empalizada
 Estreptobacilo

                                                                     Otras formas
 Actinomicetos
 Espirilos
 Espiroquetas
 Con yema
 Con pedúnculos
 Pleomorficas

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO MICROBIANO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO MICROBIANO 

Método de siembra por estría en placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún.

Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estás técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Reactivos usados en la tinción de Gram:

° Agua estéril para realizar el frotis.
° Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
° Safranina.
° Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
° Agua corriente para enjuagar.
° Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

°Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.

°Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
Flamear nuevamente el asa y esperar a que enfríe.
|Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
°Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
°Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

° Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
dejar actuar durante 60 segundos.
° Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
° Enjuagar con agua corriente.
° Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
° Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
° Enjuagar con agua corriente.
° Dejar secar a temperatura ambiente.
° Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.

Fundamento de la tinción de Gram.

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.

**El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.

**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.

Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta.

**La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol.

En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

**La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su pared célular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tinción de Gram.

–No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
–Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.
–Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

Prueba de la oxidasa.

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasale quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

° Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:
° Tetrametil-p-fenilendiamina.
° Dimetil-p-fenilendiamina.
° Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Fundamento básico:

 El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliográfia en especial el libro de Mac Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.
Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa. Control negativo: Escherichia coli.

Factores a considrerar en la pueba de oxidasa.

No considerar un resultado positivo después de 30 seg ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son:Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton

Prueba de la catalasa.

Prueba de catalasa

Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

Fundamento de la pruebe de catalasa.

El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzimallamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Control positivo: Stahylococcus aureus

Control negativo: Streptococcus pyogenes